中国科学院天工所团队构建「体外多酶催化体系」

  随着生态环境污染的加剧和人们对环境保护意识的增强，新型环保材料的研究与应用慢慢的变成为业界关注的焦点。

  作为一种具有优良生物相容性和生物可降解的生物基高分子材料，PHB（聚-3-羟基丁酸酯）备受业界关注，然而目前 PHB 的规模化生产依然存在挑战，其中之一为成本比较高，这限制了其扩大生产及应用。

  近日，中国科学院天津工业生物技术研究所游淳和团队，构建出一种新型体外多酶催化合成系统，以麦芽糊精为唯一底物通过乙酰辅酶 A 转化 PHB，产率达到 0.8 g/L/h，为今后 PHB 的规模化工业生产提供新的途径。

  这篇研究论文通讯作者游淳是中国科学院天津工业生物技术研究所研究员，他和团队的研究方向主要围绕体外生物合成系统组装的适配性、稳定性、有效性等关键科学问题，包括通过创建非天然生物酶为体外生物合成途径提供特制元件，以及建立非细胞合成途径的工业测试与调控技术为体外生物合成体系设计与定向改造提供策略，实现高的附加价值化学品生成路线的替代并降低高值化学品的生产成本。

  PHB 其实是一种存在于许多微生物细胞质内属于脂质的碳源类贮藏物，具有存储能量、碳源和降低细胞内渗透压等功能。作为一种由微生物发酵合成的天然高分子聚合物，PHB 也是一种新型环保聚酯材料，其拥有非常良好的生物相容性和降解性，对人体安全无害，且能够在自然环境中被微生物分解，不会对生态环境能够造成污染。

  然而现阶段，相比来说较高的生产所带来的成本依然是限制 PHB 材料规模生产和大范围的应用的重要的因素之一，围绕这个挑战，业界也在不断探索新方法来降低生产所带来的成本，比如通过基因工程改造微生物、优化发酵过程工艺等。

  作为一种新型生物制造平台，体外多酶催化合成系统（in vitro synthetic enzymatic biosystem，ivSEB）介导的体外生物转化能够模仿微生物体内代谢途径在无细胞环境中组合一系列酶及辅酶，遵循所设计的反应路径将底物转化为目标化合物。

  这种基于体外多酶催化合成系统的体外生物转化的合成途径通常基于天然代谢途径进行设计和优化，通过结合多个反应模块来实现，每个反应模块包含用于定向催化的酶。相较于传统的微生物发酵，体外生物转化不可能会受到细胞活性和复杂性的限制，具有可调控性强、反应速度快、副反应少、产率高等众多优势，通过合理的途径和优化的反应条件能轻松实现较快的反应速率和较高的产率，在生物合成制造领域展现出较大潜力。

  作为一种重要的平台型化合物，乙酰辅酶 A 可用于合成多种化学品，比如 PHB、正丁醇、类异戊二烯等。围绕 PHB 生物合成，现阶段业界已经构建出多种通过乙酰辅酶 A 生产 PHB 的体外合成酶生物系统。这些系统大都具有相同的下游级联途径，包括乙酰辅酶 A 转移酶（PhaA），乙酰辅酶 A 还原酶（PhaB）和 PHB 合成酶（PhaC）。

  然而，一些系统由于依赖昂贵的三磷酸腺苷（ATP），导致不具有经济效益，难以扩大到工业规模。对此，游淳和团队试图开发一种更简单、低成本的 PHB 的新体外多酶催化合成系统，以期可以在一定程度上完成更具规模和经济的效果与利益的生产。

  在这项研究中，游淳和团队设计并构建了一种包含 17 种酶、无需 ATP 的体外多酶催化合成系统，该系统能够以麦芽糊精（淀粉的衍生物）为唯一底物，通过乙酰辅酶 A 实现一锅法生物合成 PHB。

  ▲图｜从麦芽糊精中化学计量生产 PHB 的体外合成酶促途径示意（来源：Nature Communications）

  他们通过化学计量分析表明，这种体外多酶催化合成系统能自我维持 NADP+/NADPH 平衡（不需要辅酶调节模块），还可以达到133.3%的理论摩尔产率。

  利用简单的一锅法反应，他们通过拟合动力学模型进行优化后，这种体外多酶催化合成系统的 PHB产率达到 9.4 mM/h（约 0.8 g/L/h），实现了基于麦芽糊精消耗的125.5%的摩尔产率，接近理论摩尔产率（133.3%），PHB 产量为 74.9 mM（约 6.4 g/L）。

  相比传统合成方法，一锅法直接从简单的原料出发，无需中间体的分离、纯化等步骤而直接合成出最终的目标产物，其将多个步骤或操作在同一个容器中连续进行从而简化合成过程，可缩短反应时间、减少反应物的挥发和沉淀，并且在经济和环境友好方面更具优势。

  接下来，研究团队添加两种辅助酶以完全利用底物，PHB 的产量实现进一步提升，达到 208.3 mM（约 17.9 g/L）。他们在论文中指出，PHB 的产量和产率均为迄今为止报道的所有体外多酶催化合成系统中的最高值。

  研究团队表示，当底物浓度增加时，PHB 产量逐步提升，意味着这种体外多酶催化合成系统可用于大规模工业生产。

  总的来说，这项研究设计和构建的这种体外多酶催化合成系统有望被开发成一个高效体外生物转化平台，并且具有工业规模扩大前景，可使用淀粉大规模生产 PHB 以及其他乙酰辅酶 A 衍生化学品等。

  作为结构最简单、最早发现、研究最深入的可降解高分子生物材料，PHB 是最常见的聚羟基脂肪酸酯（PHA）家族成员之一。

  PHB 材料的物理性质与结构与聚丙烯相似，具有较高的机械强度以及热稳定性等，在医疗（外科缝线、血管替代、药物载体、组织工程支架等）、农业（农用薄膜、肥料包装袋、长效农药等）、工业（包装、纺织以及化妆品等）等众多领域具有广阔的应用前景。

  事实上，PHA 是一类高分子聚酯的统称，目前已发现组成 PHA 的羟基脂肪酸单体有 150 余种，单体的种类、碳链长度以及侧链基团等决定 PHA 的结构和性能。根据单体结构的不同其可分为多种类型，除了上文提到的 PHB，常见的还包括聚-3-羟基烷酸酯、聚-3-羟基戊酸酯（PHV），以及聚-3-羟基丁酸酯与 3-羟基戊酸酯的共聚物（PHBV）等。

  PHB 作为一种可降解高分子生物材料，属于第一代商业 PHA 材料。例如，PHB 在人体内可降解成属于血液成分的 3HB，不会产生排斥反应。早在 2007 年，以 P4HB 为原料的可吸收缝合线获 FDA 批准上市，成为全世界首个商业化 PHA 医疗产品。

  为了优化材料性能，研究人员后续又开发出 PHBV 材料，为 PHB 和 PHV 的共聚物，相较于 PHB 在热加工性能、韧性和延展性方面表现更佳，属于第二代 PHA 材料；如今，研究人员已经陆续开发出了第三代和第四代 PHA 材料，分别为 PHBHHx（聚 3-羟基丁酸酯-co-3-羟基己酸酯）和 P34HB（聚 3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯），在性能表现方面拥有更多提升。

  尽管聚羟基脂肪酸酯是公认为绿色环保型高分子材料，但也存在诸如疏水性强、加工窗口窄等一些缺点，对此，研究人员针对这类材料来“改性”，比如，通过引入不同的官能团或与其他高分子材料共混，可以强化 PHA 材料的机械性能、热性能等，进而能够很好的满足更多领域的不同需求。

  除了学术界研究的不断深入，政策端也为 PHA 材料的发展带来利好。例如，2021 年国内被认为是史上最严的“限塑令”正式实施，一次性的不可降解塑料吸管和包装袋等在一些特定的场所被严禁使用；去年 11 月，欧洲议会环境委员会通过了“包装和包装废弃物法规”的拟议修订案，促进再利用和回收并解决一直增长的塑料包装废弃物问题。

  日渐严峻的环境污染问题和人们对环保和可持续发展的日益关注，以及全世界禁/限塑令的陆续颁布，包括 PHB 在内的聚羟基脂肪酸酯材料产业迎来更大的发展契机。

  对此，有业内人士曾表示，“此前可降解生物基材料发展较慢主要是由于生产所带来的成本高以及推行政策不够强力，近年来欧洲国家陆续推出限塑强制政策，国内政策也愈发严格，可降解材料行业进入爆发期。随着国内规划到 2025 年逐渐扩大对一次性塑料制品的生产使用限制，这或将带来千万吨级的可降解材料替代空间。”

  产业层面，就目前而言，全世界内研发生产企业包括美国 Danimer Scientific、德国 Biomers、新加坡 RWDC Industries，以及国内的微构工场、麦得发生物、蓝晶微生物等公司。

  可以预见的是，随着学术界和产业界对包括 PHB 在内的聚羟基脂肪酸酯材料研究的深入和产能的提升，其将有望成为一种被市场广泛接受、应用领域广阔的环保材料，遏制白色污染并助力可持续发展。